Ce este o reacție în lanț a polimerazei (PCR)? fapte la test, etape și utilizate pentru

Ce este PCR (reacția în lanț a polimerazei)?

Reacția în lanț a polimerazei (PCR) este o tehnică care este utilizată pentru a amplifica urme de ADN (și în unele cazuri, ARN) localizate în sau pe aproape orice lichid sau suprafață în care pot fi depuse catene de ADN. Cheia pentru înțelegerea PCR este de a ști că fiecare om, animal, plantă, parazit, bacterie sau virus conține material genetic precum secvențe de ADN (sau ARN) (secvențe de nucleotide sau bucăți de ADN sau ARN) care sunt unice pentru speciile lor, și la membrul individual al acelei specii. În consecință, dacă un eșantion conține segmente de ADN sau ARN, PCR este o metodă folosită pentru a amplifica (face multe copii mai identice) ale acestor secvențe unice, astfel încât acestea pot fi apoi folosite pentru a determina cu o probabilitate foarte mare identitatea sursei (a persoană specifică, animală sau organism patogen) a ADN-ului sau ARN-urilor găsite în sau pe aproape orice eșantion de material.

Amplificarea PCR este doar o parte a testului de identificare. Odată ce amplificarea este făcută (vezi mai jos), segmentele amplificate trebuie comparate cu alte segmente de nucleotide dintr-o sursă cunoscută (de exemplu, o persoană specifică, un animal sau un organism patogen). Această comparație a segmentelor unice se face adesea prin plasarea secvențelor de nucleotide generate de PCR lângă secvențele de nucleotide cunoscute de la oameni, agenți patogeni sau alte surse într-un gel care separă. Curentul electric este trecut prin gel și diferitele secvențe de nucleotide formează benzi care seamănă cu o „scară” în funcție de sarcina electrică și dimensiunea moleculară a acestora. Aceasta este denumită electroforeză în gel. Benzile sau „scările” ca niște pași care migrează la aceleași niveluri în gel arată identitatea secvențelor de nucleotide. Această metodă este una dintre cele mai populare metode de testare PCR (vezi fig. 1).

Figura 1, Benzi sau „scări” precum trepte de PCR produse ADN de Mycobacterium (prin amabilitatea CDC)

Figura. Elemente repetitive (Rep) - PCR (A) și electroforeză în gel cu câmp pulsat (PFGE) (B), izolate de Mycobacterium cosmeticum izolate de la 2 pacienți din Ohio și 1 pacient din Venezuela. Rep-PCR a fost efectuat folosind primer BOXA1R (3) și PFGE a fost efectuat cu enzima de restricție AseI. Benzile 1, 2, Ohio izolează OH1 și OH2; benzile 3, 4, tulpinile de control ATCC BAA-878T și ATCC BAA-879; banda 5, izolat venezuelean VZ1. Standardele de mărime ADN sunt 100-bp (S1) și marker de 48, 5-kb (S2).

Cum se face PCR (reacția în lanț a polimerazei)?

În 1983, Kary Mullis și-a dat seama de etapele de bază pentru amplificarea secvențelor de ADN. El și Michael Smith au primit premiul Nobel pentru dezvoltarea acestei proceduri în 1993. Există câțiva pași de bază care sunt urmați în succesiune; PCR poate fi realizat într-un singur tub cu substanțe chimice adecvate și un încălzitor special conceput. Reactivii sau substanțele chimice necesare sunt următoarele:

• Un eșantion care conține o secvență de nucleotide (din sânge, păr, puroi, răzuire a pielii etc.)
• Primeri ADN: ADN scurt monocatenar care se atașează la secvențele de nucleotide care promovează sinteza unei catene complementare de nucleotide
• ADN polimeraza: o enzimă care, atunci când ADN-ul are un primer legat, coboară pe segmentul ADN care atașează blocuri de construcție ADN pentru a forma perechi de baze complementare și astfel sintetizează o catena nucleotidă complementară a ADN-ului (introducerea unui ADN polimerază rezistent la căldură, Taq polimeraza, derivată din bacteriile rezistente la căldură, a îmbunătățit semnificativ capacitatea de a efectua PCR)
• Un exces mare de blocuri de ADN numite nucleotide (adenină, timidină, citozină și guanină, prescurtate ca: A, T, C și, respectiv, G) sunt prezente în soluție. Când aceste blocuri sunt legate între ele, ele formează o secvență de nucleotide sau o singură catenă de ADN. Când aceste blocuri de construcție leagă blocul lor de construcție complementar prin legături slabe de hidrogen (de exemplu, A se leagă doar cu T și G doar cu C) se formează o secvență complementară de nucleotide ADN și se leagă la ADN-ul monocatenar original. Când legarea este finalizată, se formează un ADN dublu catenar complementar într-o secvență specifică.

PCR, apoi, începe cu un segment de ADN dintr-un eșantion care este plasat într-un tub cu reactivii enumerați mai sus. Soluția este încălzită la cel puțin 94 ° C (201, 2 F); această căldură sparge legăturile de hidrogen care permit formarea catenelor de ADN complementare, deci în amestec există doar catenele unice (aceasta se numește denaturarea ADN-ului dublu-catenar).

Amestecul este lăsat să se răcească până la aproximativ 54 C (129, 2 F). La această temperatură, primerii ADN și ADN-polimeraza se leagă de ADN-ul individual cu o singură catenă (aceasta se numește recoacere de ADN). Deoarece blocurile sunt în exces (concentrație ridicată) în amestec, polimeraza le folosește pentru a crea noi surse complementare de ADN (denumită extensie a ADN-ului) și acest proces este mai rapid la 72 C (161, 6 F). Acest procedeu creează o nouă moleculă de ADN cu două căi din fiecare dintre catenele unice ale moleculei originale.

Acest ciclu se repetă de aproximativ 40 de ori într-o mașină denumită un cicler termic care repetă automat ciclurile de încălzire-răcire, cantitatea fiecărei secvențe ADN dublându-se de fiecare dată când ciclul de încălzire-răcire este finalizat. Ceea ce inițial a fost un singur segment scurt de ADN poate fi amplificat la aproximativ 100 de miliarde de copii după 40 de duble cicluri.

De ce un medic ar comanda un test PCR (reacția în lanț a polimerazei)?

Testul PCR constituie baza unui număr de teste care pot răspunde la multe întrebări medicale diferite care ajută medicii să diagnostice și să trateze pacienții. De exemplu, testele PCR pot detecta și identifica organismele patogene la pacienți, în special la cele dificil de cultivat (de exemplu, HIV și alte virusuri și anumiți ciuperci).

Alți medici comandă teste PCR pentru a ajuta la diagnosticarea bolilor genetice, în timp ce alți medici utilizează PCR pentru a detecta relații biologice, precum identificarea părinților copiilor. Testele PCR sunt, de asemenea, utilizate pentru a identifica și caracteriza mutațiile genetice și rearanjamentele găsite în anumite tipuri de cancer.

Cu toate acestea, testele PCR au fost modificate și extinse în multe aspecte ale investigațiilor științifice, inclusiv biologie evolutivă, amprentă genetică, investigații medico-legale și multe altele.

Ce este RT-PCR?

RT-PCR este un test PCR care este proiectat pentru a detecta și măsura ARN. Deși testele PCR inițiale au amplificat ADN-ul, mulți viruși și alte componente biologice (de exemplu, mitocondrii) utilizează ARN ca materialul lor genetic. RT-PCR diferă de PCR convențional, luând mai întâi ARN și transformând catena ARN într-o catena ADN. Aceasta se realizează prin aceeași metodă pentru PCR descrisă mai sus, cu excepția utilizării unei enzime denumite transcriptază inversă în loc de ADN-polimerază. Transcriptaza inversă permite traducerea unei singure catene de ARN într-o catena complementară a ADN-ului. Odată ce reacția are loc, metoda PCR de rutină poate fi apoi utilizată pentru a amplifica ADN-ul. RT-PCR a fost utilizat pentru a detecta și studia multe virusuri ARN.

RT-PCR nu trebuie confundat cu o altă variantă a PCR, denumită PCR în timp real. PCR în timp real este o variație a PCR care permite analiza ADN-ului amplificat în timpul obișnuitelor 40 de cicluri ale procedurii. Deși procedura este similară cu PCR-ul convențional cu ciclismul, PCR în timp real folosește coloranți fluorescenti atașați la unele dintre blocurile de construcție sau catene mici de nucleotide. În funcție de metoda folosită, fluorescența apare atunci când se formează catene de ADN amplificate. Cantitatea de fluorescență poate fi măsurată pe parcursul celor 40 de cicluri și permite investigatorilor să măsoare anumite produse și cantitățile acestora în timpul ciclurilor de amplificare. Acest lucru permite adesea investigatorilor sau tehnicienilor de laborator să sară electroforeza pe gel sau alte proceduri secundare necesare pentru analiza produselor PCR, producând astfel rezultate mai rapide.

PCR în timp real și RT-PCR sunt variații sau modificări ale testului PCR inițial. Cu toate acestea, există multe alte variații (cel puțin 25) care există și sunt folosite pentru a rezolva probleme specifice. Toate au denumiri diferite, cum ar fi PCR de asamblare, PCR de pornire la cald, PCR Multiplex, PCR cu fază solidă și multe altele.

PCR este probabil să continue să fie modificat pentru a ajuta la răspuns la orice alte întrebări din medicină, biologie. și alte domenii de studiu.